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            常見問題

            使用革蘭氏染色機的實驗方法

            日期:2016-10-04 10:25:01 訪問次數:1307

            革蘭氏染色機使用步驟


            我們革蘭氏染色機染色過程使用的是三步法,使用時設定染色的各個參數,按“運行”后儀器自動染色。革蘭氏染色機的染色方法為:

            1.固定

            2.結晶紫染色

            3.洗滌

            4.碘溶液媒染

            5.洗滌

            6.品紅染液脫色復染

            7.洗滌

            8.高速甩干

            革蘭氏染色原理

            通過結晶紫初染和碘液媒染后,在細胞壁內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物,革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚、肽聚糖網層次較多且交聯致密,故遇乙醇或丙酮脫色處理時,因失水反而使網孔縮小,再加上它不含類脂,故乙醇處理不會出現縫隙,因此能把結晶紫與碘復合物牢牢留在壁內,使其仍呈紫色;而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高、肽聚糖層薄且交聯度差,在遇脫色劑后,以類脂為主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖網不能阻擋結晶紫與碘復合物的溶出,因此通過乙醇脫色后仍呈無色,再經沙黃等紅色染料復染,就使革蘭氏陰性菌呈紅色。
            染色的差異主要是由于陰性與陽性細菌細胞壁的差異所引起的。
            ①革蘭氏陽性細菌的細胞壁
            G+細菌細胞壁具有較厚(20-80nm)而致密的肽聚糖層,多達50層,占細胞壁成分的40%~95%,它同細胞膜的外層緊密相連(圖2-9)。有的G+細菌細胞壁中含有磷壁酸(teichoic-acid),也稱胞壁質(murein),它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負電荷,它在細胞表面能調節陽離子濃度。磷壁酸與細胞生長有關,細胞生長中有自溶素(autolysins)酶類起作用,磷壁酸對自溶素有調節功能,阻止胞壁過度降解和壁溶。
            如果細胞壁的肽聚糖層被消溶,G+細胞成為原生質體(protoplasts),細胞壁不復存在,而只存留細胞膜。除鏈球菌外,大多數G+細菌細胞壁中含極少蛋白質。
            ②革蘭氏陰性細菌的細胞壁 G—細菌細胞壁比G+細菌細胞壁薄(15~20nm)而結構較復雜,分外膜(outer membrane)和肽聚糖層(2~3nm)(圖2-10)。在細胞壁和細胞質膜之間有一個明顯的空間,稱為壁膜間隙(periplasmic space)。
            外膜 G—細菌細胞壁外膜的基本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同細胞質膜相同之處也是雙層類脂,但除磷脂外還含有多糖和蛋白質。
            LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特異多糖。O-特異多糖由重復分支的碳水化合物分子組成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖)和二脫氧已糖。由于糖的種類不同,使各種G—細胞具有不同特性的LPS。核心多糖(core polysaccharide)的主要組分是酮脫氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO)。
            外膜中還含有幾種蛋白,如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用(porin),調控外界分子進入細胞;有的蛋白分子可以作為噬菌體的受體;許多G—細菌對高等生物有致病性是由LPS的成分決定的,它的毒性組分常稱為內毒素(endotoxins)。
            肽聚糖層 G—細菌細胞壁的肽聚糖層很薄,在大腸桿菌和其它細菌中僅有單
            層。肽聚糖層和外膜的內層之間通過脂蛋白連接起來。
            壁膜間隙 G—細菌細胞壁的外膜與細胞質膜之間存在明顯的壁膜間隙,一層薄的肽聚糖處于其間,肽聚糖層和細胞質膜之間的間隙較寬,肽聚糖層至外膜之間的間隙較窄。大腸桿菌的壁膜間隙寬度為12~15nm,呈膠胨態。其間含有三類蛋白質:水解酶,催化食物的初步降解;結合蛋白,啟動物質轉運過程;化學受體(chemoreceptors),在趨化性中起作用的蛋白。

            染色結果

            革蘭氏陽性菌呈藍紫色,革蘭氏陰性菌呈紅色。
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